在肿瘤高通量测序应用中，可衍生出三种常见方案：肿瘤Panel、全外显子（WES）和全基因组（WGS）。其中，全外显子是一种针对人类基因的外显子进行检测的方法，在临床应用上还具有诸多优势。

作为肿瘤突变负荷（TMB）检测的金标准，WES可为肿瘤免疫治疗选择提供依据。此外，它能为肿瘤微小残留病（MRD）检测提供突变信息，让变异标志物的选择更加游刃有余，为肿瘤治疗方案评估、复发监控等提供更多参考；还可以通过构建患者个体的全外突变谱，在个性化肿瘤疫苗制备中，筛选更为有效的新生抗原。

 

之所以选择WES，是由于与全基因组测序（WGS）相比，其位点数仅为1%，却覆盖了大部分基因组编码区，还可以灵活添加其他区域，例如线粒体、CNV和病毒模块等。因此，WES是一种相对简便、快速的诊断方案，也被认为是目前临床应用中最具性价比的基因检测技术之一。

 

而与固定的panel相比，肿瘤异质性与Panel基因固定的矛盾很难” One Size Fits All”（图1）。随着测序平台国产化趋势越来越明显，测序成本大幅下降，WES在肿瘤临床的应用也越来越广泛。

图1. 上图：50例NSCLS患者体细胞突变重合比例（TCGA）[1] 。下图：WES检测到的突变基因与商品化Panel基因List的重合基因数量。上方Panel，10例NSCLC队列数据；下方Panel，1059例NSCLC TCGA数据；红色方框为根据WES突变谱设计的个性化Panel，蓝色方框是固定基因的商品化Panel[1]。

作为国内靶向捕获技术的佼佼者，伯科生物对其设计与生产的当家WES panel（TargetCap Core Exome Panel v3.0）进行了全面测评，并评估了其在华大智造（MGI）测序平台的数据表现。

结果显示，华大智造测序平台的表现超出预期。下文将阐述测评数据质量、覆盖度等方面的质量指标，变异结果将在下篇进行展示。

实验设计

1 WES Panel：伯科生物自主研发生产的TargetCap Core Exome Panel v3.0，由近40万条120nt ssDNA探针组成。

2 样本：采用含有不同突变数量的5套TMB gDNA标准品（Set 1-5），每套标准品由不同等位基因频率的5个样本组成（0%-40%），共25例样本，按照样本质量的高低分为两类，分别为稍低质量样本（LQ，15例）和高质量样本（HQ，10例）。

3 建库与测序：对上述25例样本构建华大智造平台的双端Index文库，按照5-Plex与TargetCap Core Exome Panel v3.0杂交16h，在 MGISEQ-2000平台进行150PE测序50Gb以上，随机抽取10Gb进行数据质控。

图2. TargetCap Core Exome Panel v3.0测试实验流程

测评结果

冗余数据低至2%

华大智造平台保持着一如既往的低冗余度约~2%。这得益于华大智造平台 DNBSEQ的非线性扩增技术，同样的数据量10G下，MGISEQ-2000能够获得更高的平均测序深度，达到131x。换个角度说，如果要达到相同的测序深度，华大智造平台可有效节省测序成本。

图3. MGI平台信号放大示意图

99.8%超高目标区域覆盖率

目标区域覆盖率在MGISEQ-2000达到总体99.8%，LQ 99.7%，HQ 99.9%，高质量样本覆盖率稍高于稍低质量样本。

99.4%超高0.2x Mean Depth覆盖率

1.低深度区域占比

0.2x Mean Depth: 25个样本在华大智造平台的均值为99.4%，LQ和HQ样本在MGISEQ-2000上分别表现为99.3%和99.6%。

0.5x Mean Depth: 25个样本在华大智造平台的均值为92.9%，LQ和HQ样本在MGISEQ-2000上分别表现为92.5%和93.4%。

2.整体均一性（Fold 80）

华大智造平台上Fold80值为1.44，在不同质量样本中差别不大。

 

数据表明，在WES的各项关键指标中，华大智造MGISEQ-2000的表现优异。总结如下表：

CV低至0.1%

数据的稳定性至关重要，而本次测评也对以上指标的稳定性进行了评估。简单来说，就是测了以上指标的CV值（变异系数，Coefficient of Variation），结果同样令人惊喜。

对于总体25例样本，除Duplication参数外，其他各项参数的CV值均控制在3.1%及以下，覆盖率和0.2x Mean Depth覆盖率更低至0.1%，数据表现出极佳的稳定性。至于冗余率（Duplication）的CV值达到13.5%，由于MGISEQ-2000的冗余率已经低至2.2%，这个CV值可以忽略不计。

图4. TargetCap Core Exome Panel v3.0各指标CV值

在后续文章中，我们将给大家带来TargetCap Core Exome Panel v3.0在MGISEQ-2000平台变异检测方面的内容，敬请期待。

华大智造MGISEQ-2000适配应用

参数解释

对于靶向测序数据的评估，冗余度和中靶率决定了有效数据，即平均测序深度，而覆盖均一性则决定了有多少目标区域能够用于最终分析，FDA所批准的全外产品Omics Core规定平均测序深度≥500x，0.2x Mean Depth≥95%（≥100x的目标区域占比）。

和木桶效应一样，木桶够高还不行（平均测序深度），能盛多少水取决于最矮的木板（0.2x Mean Depth）；除了最矮的木板，还有一些木板稍高，他们就是0.3、0.4、0.5…x Mean Depth等，对于体细胞突变分析，当然是“多多益善”，即更多的区域达到更深的测序深度，因此0.3-1.0x Mean Depth的值越高越好。

图5. 靶向测序评估参数示意图

除此之外，还有一个评估均一性的参数叫Fold 80，计算公式为平均深度/80%以上目标区域覆盖的深度，低于2.0均一性较好，可以理解成评估整个决口的大小。

*以上评测结果来自伯科生物

参考文献

[1] Reinert T , Henriksen T V , Christensen E , et al. Analysis of Plasma Cell-Free DNA by Ultradeep Sequencing in Patients With Stages I to III Colorectal Cancer[J]. JAMA Oncology, 2019, 5(8).